菌落總數(shù)的測(cè)定,只做一個(gè)稀釋度行嗎？

01菌落總數(shù)的測(cè)定,只做一個(gè)稀釋度行嗎？

可行但不推薦。在GB4789.2-2022中6.1.5要求：根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇1個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），吸取1mL樣品勻液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。在此條款要求下，檢測(cè)一個(gè)稀釋度是合規(guī)的，但是因?yàn)楹芏嗲闆r下，我們對(duì)樣品內(nèi)所含微生物的濃度是不確定的，如此只做一個(gè)稀釋度，無法保證我們所做的稀釋度是否是“適宜"的，增加了后面計(jì)數(shù)和報(bào)告的不確定性。但如果該樣品是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常檢驗(yàn)的，對(duì)樣品菌落總數(shù)的結(jié)果有比較準(zhǔn)確的估計(jì)，那么只測(cè)一個(gè)稀釋度也是合規(guī)的。但無論哪種情況，即使一個(gè)樣品已經(jīng)基本可以確定了菌落數(shù)了，也建議多檢測(cè)一個(gè)稀釋度，多一個(gè)稀釋度也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，只測(cè)一個(gè)稀釋度會(huì)存在風(fēng)險(xiǎn)。

02 同一個(gè)稀釋度，菌落總數(shù)一個(gè)在計(jì)數(shù)范圍，一個(gè)不在計(jì)數(shù)范圍，怎么計(jì)？

同一稀釋度的兩個(gè)平板，一個(gè)在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，一個(gè)不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，則以在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)的平板的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作為報(bào)告結(jié)果。

舉例來說明，某樣品檢測(cè)結(jié)果：1:10稀釋度的兩平板菌落數(shù)分別為320、288，1:100稀釋度兩平板菌落數(shù)為27、23，則樣品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)選取288進(jìn)行報(bào)告，報(bào)告結(jié)果為2.9*103CFU/g。

03 涂抹樣品的檢測(cè)，應(yīng)當(dāng)怎樣計(jì)數(shù)和報(bào)告？

涂抹樣品檢測(cè)的計(jì)數(shù)是比較復(fù)雜的，給大家舉例子來說明！

假如你涂抹的樣品面積是25cm2，采樣的涂抹液是10mL，而檢測(cè)只吸取1mL樣液，即檢測(cè)的是原樣品的10-1的稀釋度，即平板計(jì)數(shù)菌落*10為樣品中的菌落數(shù)。結(jié)果報(bào)告就是菌落數(shù)/取樣面積。例如，取樣面積是25cm2，檢測(cè)平皿上計(jì)數(shù)為13，則結(jié)果報(bào)告應(yīng)該為13*10CFU/25cm2。

04 培養(yǎng)基配置有哪些注意事項(xiàng)？

(1) 滅菌溫度要嚴(yán)格控制，按照要求滅菌，尤其含糖量較高的培養(yǎng)基溫度不應(yīng)太高，過高會(huì)導(dǎo)致糖分焦化，影響質(zhì)量；

(2) 瓊脂培養(yǎng)基不能反復(fù)溶化。反復(fù)溶化會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分；

(3) 培養(yǎng)基不能反復(fù)滅菌，反復(fù)滅菌也會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)成分的破壞；

(4) 含瓊脂的培養(yǎng)基滅菌后，要搖勻。

05 剩余的培養(yǎng)基再次使用是否重新滅菌？

這分為兩種情況。第一種情況，已經(jīng)凝固后重新融化后使用的，根據(jù)GB4789.28-2013中明確規(guī)定，未用完的培養(yǎng)基不可重新凝固留待下次使用。遇到這種情況，培養(yǎng)基只能棄置，并且國標(biāo)要求，棄置也需要符合相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)定。

第二種情況，滅菌后未開封使用的培養(yǎng)基，可待培養(yǎng)基凝固后再進(jìn)行保存。但保存條件需避光干燥，保證其成分不會(huì)發(fā)生改變。再次使用時(shí)按照要求進(jìn)行融化即可，不可二次滅菌。滅菌已開封但未使用完的培養(yǎng)基，不建議再次使用，畢竟存在風(fēng)險(xiǎn)。但若是液體培養(yǎng)基，就不存在融化的過程，滅菌后未使用完畢可按照國標(biāo)要求保存，使用時(shí)需要保證培養(yǎng)基成分不發(fā)生改變，不可進(jìn)行二次滅菌。若無法保證培養(yǎng)基是否符合要求，應(yīng)當(dāng)棄置。

06 霉菌計(jì)數(shù)如何保證結(jié)果準(zhǔn)確？

霉菌菌落由孢子和菌絲組成，相當(dāng)擴(kuò)散，在直徑9cm的平皿里，菌落數(shù)稍多就相互交叉重疊，影響計(jì)數(shù)，但數(shù)量太少又會(huì)產(chǎn)生較大的誤差，因此選擇適當(dāng)?shù)南♂尪扔?jì)數(shù)是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

我們對(duì)這方面作了一些觀察研究，首先是將實(shí)驗(yàn)菌株的斜面培養(yǎng)物制成含有約106個(gè)/ml的孢子懸液，并用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，然后將孢子懸液作10-1~10-6倍稀釋，吸取不同稀釋度的稀釋液接種于PDA，25℃培養(yǎng)5天后計(jì)數(shù)。30種常見霉菌的兩種不同計(jì)數(shù)方法所得結(jié)果比較顯示，大部分菌株每平板含有10~50個(gè)菌落的稀釋度時(shí)的計(jì)數(shù)與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果接近；有近一半的菌株，每個(gè)平板含50~100個(gè)菌落已較難計(jì)數(shù)，而大部分菌株，超過100個(gè)/平皿或小于10個(gè)/平皿的計(jì)數(shù)結(jié)果就與顯微計(jì)數(shù)結(jié)果存在較大差別，因此，應(yīng)盡量選擇10~50個(gè)/平皿的稀釋度進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)。

而對(duì)上述提及的菌絲很豐富、菌落特別擴(kuò)散的毛霉、根霉、犁頭霉等菌株，則應(yīng)在更少的范圍內(nèi)計(jì)數(shù)(30個(gè)/平皿以內(nèi))。為控制霉菌的生長速度和菌落的生長范圍，可在培養(yǎng)基中添加少量抗生素，如氯霉素(50~100mg/L)，金霉素(20~100mg/L)，慶大霉(50mg/L)，土霉素(100mg/L)等。

07 無菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液三者有什么區(qū)別？

無菌水就是簡(jiǎn)單的檢測(cè)水進(jìn)行滅菌；生理鹽水是0.85%的NaCl水溶液；磷酸鹽緩沖液一般是選擇磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉按照一定比例配制的緩沖液。

在食品微生物檢測(cè)中，三者最主要的區(qū)別在于對(duì)菌的保護(hù)作用。無菌水不存在對(duì)菌的保護(hù)，因?yàn)闈B透壓的作用，還可能造成菌吸水脹裂死亡；生理鹽水的滲透壓基本與菌的細(xì)胞液相當(dāng)，會(huì)對(duì)菌有一定的保護(hù)。磷酸鹽緩沖液除了在滲透壓方面對(duì)菌有保護(hù)作用，對(duì)pH也有一定的緩沖作用，因此對(duì)菌有更好的保護(hù)。國標(biāo)要求，微生物檢測(cè)需要用生理鹽水或磷酸鹽緩沖液稀釋。但也有部分研究表明，檢測(cè)樣品若NaCl含量超過10%也可以使用無菌水稀釋，但并未被國家標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)可。

08 培養(yǎng)皿接種后為什么要倒置？

接種后，將平板倒置，既可防止冷凝水滴到培養(yǎng)基上，避免雜菌污染；又利于菌種的生長、繁殖和計(jì)數(shù)。

1.利于菌種的生長和繁殖

培養(yǎng)條件為必須通風(fēng)時(shí)，倒置的平板可以減少培養(yǎng)基表面的空氣流動(dòng)，減慢培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)的速度，保持瓊脂等固體培養(yǎng)基中的水分，充分的維持瓊脂等凝固劑的彈性，延長培養(yǎng)基出現(xiàn)干裂的時(shí)間。所以，倒置培養(yǎng)有利于菌種的繁殖和生存。如果將平板正放，大概幾天時(shí)間培養(yǎng)基就會(huì)出現(xiàn)水分散失和開裂的情況?？梢?，防止培養(yǎng)過程中水分散失是非常重要的。

2.防止培養(yǎng)過程中雜菌污染平板

倒置培養(yǎng)時(shí)，由于平板內(nèi)的空氣不易流動(dòng)，能盡可能的減少外來雜菌的侵染，避免雜菌污染培養(yǎng)基和培養(yǎng)物。通過實(shí)驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)如果平板正放，平板的周邊容易長出雜菌菌落。

3.有利于營養(yǎng)物質(zhì)富集，方便觀察計(jì)數(shù)

平板倒置進(jìn)行微生物培養(yǎng)時(shí)，受重力的影響，一方面培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)主要會(huì)富集在培養(yǎng)基表面及表面以下的次層，有利于微生物生長；另一方面培養(yǎng)基表面生長的菌落相對(duì)不會(huì)太快擴(kuò)散，觀察時(shí)有利于辨別菌落特征。

4. 其他
1）由于現(xiàn)在一般拿平板的操作均為：小蓋子朝向手心，五指張開抓住平板，大拇指推動(dòng)平板的大蓋子進(jìn)行操作，所以倒置平板有利于操作；
2）其他人打開培養(yǎng)箱的時(shí)候一不小心就把平皿蓋給打開，倒置培養(yǎng)的時(shí)候不容易打開。